8.1.5.Физиология микроорганизмов

8.1.5.Физиология микроорганизмов

Физиология изучает процессы, происходящие в организме. Бактериальная клетка вырабатывает и выделяет в окружающую среду экзоферменты, которые переводят питательные вещества в состояние истинных растворов. Эти растворы под влиянием осмоса проходят через внешнюю оболочку клетки, при помощи другой группы ферментов (эндоферментов) переводятся в состояние коллоидов и свободно проходят через внутреннюю оболочку. С участием соответствующих эндоферментов коллоиды разрушаются, а потом синтезируются в биомассу. Часть питательных веществ расходуется для энергетических нужд, а остальная затрачивается на рост клеток. Образующиеся продукты метаболизма (жизнедеятельности) переводятся в растворимое состояние и выводятся из клетки. Между клеткой и водной средой происходит массобмен, заключающийся в поступлении питательных веществ, и в удалении продуктов метаболизма. Массобмен лимитируется условиями диффузии молекул субстрата и продуктов метаболизма через слой связанных с клеткой молекул воды (слой Нернста). Его толщина зависит от гидродинамических условий и максимальна, если скорость относительного движения клеток и потока воды близка к нулю. Таким образом, в неподвижной воде условия массобмена неблагоприятны, что понижает физиологическую активность клеток (8.7).

В зависимости от рода питания различают метатрофы, использующие органику, и прототрофы, использующие  неорганические соединения.

Эндогенным дыханием микроорганизмов называется процесс получения энергии, необходимой для жизнедеятельности. Этот процесс осуществляется путем ферментивных окислительно-восстановительных реакций.

В них участвуют ферменты из группы оксиредуктаз. Механизм процесса заключается в переносе электронов от субстрата к акцептору, которым может быть кислород или молекулы с ненасыщенными связями. Отрыв электронов происходит при окислении атомов водорода, входящих в состав вещества субстрата, до Н⁺, а также азота, серы и других доноров (табл. 8.3).

Если акцепторами электронов является несвязанный кислород – дыхание называется аэробным, в других случаях – анаэробным.

Микроорганизмы, ферменты которых участвуют в процессах дыхания, относятся, соответственно, к аэробным и анаэробным.

При аэробном дыхании выход энергии в несколько раз выше, чем при аеаэробном. Поэтому анаэробные процессы сравнительно с аэробными замедленны, а количество энаэробов, необходимых для минерализации единицы массы органики, значительно больше, чем аэробов.

Таблица 8.3

Характеристика некоторых процессов эндогенного дыхания

Для жизнедеятельности клеток необходимы основные элементы питания (углерод, азот, кислород, водород и фосфор), а так же микроэлементы: железо, марганец, сера, калий и другие. Если содержание необходимых элементов недостаточно, их следует дополнительно вносить в воду, направляемую на биохимическую очистку (биогенные добавки).

8.1.6. Закономерности синтеза биомассы

В процессе развития микробиальной культуры происходит прирост ее массы. Скорость прироста зависит от многих факторов: обеспеченности питательными веществами, соотношения компонентов, входящих в состав субстрата, накопления в воде продуктов метаболизма или других ингибиторов. Факторы, радикально влияющие на прирост биомассы, называются лимитирующими.

Скорость прироста биомассы может оцениваться по своему абсолютному значению и в каждый момент времени равна:

V_np = dm / dt,

где dm – прирост биомассы за период времени dt.

Чаще в расчетах используется понятие об удельной скорости прироста М, равной абсолютной скорости, отнесенной к исходной массе m.

Если процесс идет только в присутствии одного лимитирующего компонента, то удельная скорость прироста биомассы прямо пропорциональна его конечной концентрации S*:

M = k [S*].

Константа скорости реакции k есть ее скорость при условии, что концентрация S* постоянна и равна единице. На рис. 8.3 приведен график, устанавливающий связь между удельной скоростью М и концентрацией лимитирующего компонента [S*]. Форма графика аналогична графику на рис. 8.2. Величина удельной скорости прироста определяется по формуле Моно:   ,                       (8.5)

 где М – удельная скорость роста, М_max – максимальная удельная скорость роста, [S*] – остаточная концентрация лимитирующего вещества, K_S* – константа реакции, численно равная концентрации лимитирующего вещества для скорости прироста, равной половине максимальной. При избытке лимитирующего вещества (если оно необходимо для роста) устанавливается постоянная и максимальная удельная скорость, а K_S* = 0.

Если лимитирующим является вещество, угнетающее культуру, например, продукты метаболизма, то удельная скорость М*:

,                                    (8.6)

где М – удельная скорость прироста в случае отсутствия угнетающего вещества, [Р] – концентрация угнетающего вещества.

Уравнение Моно чрезвычайно упрощено, что следует учитывать при его применении.

Принципиальные закономерности развития микробиальных культур можно проследить по результатам наблюдений за их ростом в неподвижной среде. Развитие культуры проходит несколько фаз (рис. 8.4). Первоначально (первая фаза) происходит адаптация, увеличивается размер клеток и это приводит к некоторому приросту биомассы. Затем (вторая и третья фазы), абсолютная скорость роста увеличивается, а относительная остается постоянной. Фаза замедленного роста характеризуется уменьшением относительной и абсолютной скоростей, а прирост биомассы менее интенсивен. Для пятой, стационарной фазы рост и отмирание клеток приближаются к равновесию; наконец, наступает фаза отмирания и происходит автолиз клеток (автолиз – отмирание и распад клеток под действием ферментов, выделяемых живыми клетками).Удельная скорость роста зависит от физиологической активности клетки qф. Физиологическая активность характеризует потребность клетки в питательных веществах для обеспечения нормальных условий жизнедеятельности и при их ухудшении снижается. Физиологическая активность определяется по зависимости:

 q_ф = аМ + в,                                       (8.7)

где а – трофический коэффициент, показывающий затраты питательных веществ на образование единицы биомассы, в – коэффициент основного обмена, показывающий расход питательных веществ на поддержание жизни единицы биомассы в течение одного часа.

Коэффициенты а и в для определенной культуры и стабильных условий ее развития есть величины постоянные.

В процессе биохимической очистки прирост биомассы должен быть минимальным, т.к. при этом упрощается иловое хозяйство. Снижение скорости роста приводит к более глубокому распаду субстрата, но связано с уменьшением физиологической активности микроорганизмов. Как следует из рис. 8.4 оптимальные для очистки условия складываются в пятой, стационарной фазе развития. В тех случаях, когда глубокая очистка не требуется, возможен процесс очистки и для условий третьей фазы (логарифмического роста), а при необходимости максимально глубокой очистки – процесс ведется в условиях фазы отмирания.

8.1.7. Влияние внешних факторов на микроорганизмы

К основным внешним факторам относятся: температура воды, ее химический состав, концентрация субстрата.

Влияние температур. Температура воды влияет на скорость ферментивных реакций и на структуру клеточных компонентов. В соответствии с этим результат изменения температуры проявляется немедленно или, а в последнем случае, после достаточно длительного температурного воздействия.

По отношению к температуре, требующейся для нормальной жизнедеятельности, микроорганизмы делятся на три группы: психрофилы, мезофилы и термофилы.

Психрофилы (психрос – холод) приспособлены к существованию при температурах от –8 до +10 °С, но жизнеспособны и при более высоких температурах (до +30 °С). Физиологическая активность психрофилов мала и их редко используют в системах очистки.

Мезофилы (мезо – средний) нормально развиваются в интервале температур от +15 до +40 °С, хотя этот интервал условен. Биохимическая очистка воды обычно производится культурами мезофильных микроорганизмов.

Термофилы (термо – тепло) жизнеспособны при температурах от 30 до 70 °С. Как и в других случаях интервал температур условен и для разных культур различен.

Для конкретных культур существуют оптимальные значения температур. Так, для термофильных микроорганизмов, при помощи которых происходит анаэробная стабилизация осадков, оптимальной считается температура +52 – 53 °С, для мезофильных при аэробной очистке сточных вод в биофильтрах и аэротенках допустимы температуры до +25 °С и т.д.

Постепенное изменение температур воды в относительно больших интервалах не опасно для микроорганизмов, которые способны адаптироваться к новым условиям. Вместе с тем, внезапное изменение температуры воды даже в пределах 10–15 °С способно вызывать массовое отмирание микроорганизмов.

Влияние химического состава. Значение рН влияет на состояние ферментов и, в частности, на структуру белковой части их молекул.

Оптимальные значения рН различны для разных ферментов и ограничены интервалом 1–2 единицы, хотя область, в которой соответствующие микроорганизмы могут существовать, достигает 5–6 единиц.

В зависимости от рН биохимические процессы могут идти по разным маршрутам с получением разных конечных продуктов. Так, если денитрификация осуществляется при рН более 7, конечный продукт – молекулярный азот, если рН менее 7, то NO или N₂O.

Аэробные процессы носят окислительный характер и для них значение окислительно-восстановительной мощности системы rН₂ должна составлять не менее 20 – 25. Как следует из рис. 6.14 значение Е_n следует поддерживать в пределах +0,2 – +0,4 В. Повышение rН₂ до 30 и более нежелательно, т.к. избыток кислорода угнетающе действует на микроорганизмы. В процессе аэробной очистки rН₂ уменьшается.

Для анаэробных процессов окислительно-восстановительная мощность системы принимается около 10–12, но не более 18–20. Последнее условие связано с ограничением насыщения кислородом воды при анаэробной очистке.

В ходе анаэробной очистки rН₂ несколько увеличивается.

Химические вещества могут оказывать на популяцию микроорганизмов как угнетающее, так и стимулирующее влияние. Это зависит от дозы примеси, от присутствия других примесей, взаимодействующих с данной, продолжительности контакта, рН, Е, температуры воды и других.

Так, при концентрации аммиака до 250 мг/л анаэробный процесс в метантенках интенсифицируется, при 250–1200 мг/л определенное воздействие не проявляется, 1800–3500 мг/л – возникает ингибирование процесса, а при больших концентрациях аммиак токсичен по отношению к клеткам.

Наибольшее бактерицидное влияние фенолов проявляется при концентрации 50 мг/л, этилового спирта – 70 мг/л и т.д. ПДК веществ в воде, поступающей на биохимическую очистку, обычно принимается 15–30 % от концентраций, обуславливающих максимальное токсическое воздействие. Так, ПДК фенолов составляет 15 мг/л, этилового спирта – 14 мг/л. ПДК свинца, кадмия, титана, шестивалентного хрома – 0,1 мг/л, а ртути – 0,001 мг/л.

Одновременное присутствие нескольких разных примесей может либо взаимно усилить ингибирование, т.е. торможение путем понижения активности ферментов (эффект синергизма), либо, наоборот, снизить угнетающее влияние (антогонизм).

Микробы адаптируются к различным химическим веществам при условии, что концентрации последних меняются постепенно. Продолжительность адаптации зависит от конкретных условий и продолжается от 1–2 суток до нескольких месяцев [28].

Процесс адаптации приводит к увеличению сродства вырабатываемых клетками ферментов с субстратом, либо к изменению скорости продуцирования фермента.

В первом случае меняется состав биоценоза, во втором – состав остается прежним, но изменяется активность клеток.

Адаптация, которая сопровождается перестройкой биоценоза и накоплением адаптированных форм микроорганизмов, необходима при очистке промышленных сточных вод, содержащих такие примеси, как бензол, толуол, метилфениловый эфир, некоторые альдегиды (фурфурол, акролеин, бензойный и масляный альдегид), хлорфенол, многие нитрилы и СПАВ.

Влияние концентрации субстрата. Изменение концентрации субстрата требует адаптации микробов чаще всего путем изменения микробиальной массы, в результате чего восстанавливается равновесие между содержанием субстрата и количеством вырабатываемого фермента.

Для установки биохимической очистки (например, для аэротенка), работающей в стационарных условиях, микробиальная масса (активный ил) находится в адаптированных условиях. Если концентрация субстрата не превышает уровня, при котором произошла адаптация, то скорость изъятия загрязнений обусловлена содержанием субстрата. Повышение его концентрации сверх оптимального  не приводит к увеличению скорости изъятия, а наоборот, понижает ее (рис. 8.5). Оценивая влияние концентрации субстрата на скорость биохимической очистки констатируем, что между концентрациями субстрата и ферментов существует прямая зависимость. В стабильных условиях эти концентрации оказываются сбалансированными.

 При нарушении баланса путем повышения концентрации субстрата сравнительно со сложившимся адаптационным уровнем, скорость процесса лимитируется концентрацией фермента, отвечающей адаптационному уровню. Если концентрация субстрата понизится сравнительно с адаптационной, то скорость процесса будет зависеть только от концентрации субстрата.

Мутация (от лат. – изменение) части клеток меняет биохимические условия и характер ферментов, вырабатываемых бактериальной массой. Нередко это приводит к позитивным результатам: интенсификации процесса деструкции субстрата или к расширению диапозона соединений, подвергающихся биохимической очистке.

Специальная обработка биомассы с целью вызвать мутацию клеток (мутагенез) осуществляется как химическими (с использованием реагентов), так и физическими методами (ультразвуковое облучение, магнитная обработка, создание электрического поля, гидродинамическая обработка). Мутагенез проводится для 0,1 % и менее от общего количества клеток биомассы.

По исследованию НИИ ВОДГЕО гидродинамический мутагенез активного ила аэротенков для очистки городских сточных вод, разрушающий защитный слой Нерста, повышает производительность сооружения на 150–250 %, снижает иловый индекс на 30–50 %, прирост избыточного ила – на 30–80 % [34].

8.2. Биохимические процессы очистки в аэробных условиях

8.2.1. Общие сведения

Биохимическая очистка от органических соединений осуществляется с участием гетеротрофов, т.е. микроорганизмов, для которых источником питания является углерод органики: белков, жиров, углеводов, углеводородов и т.д. Ц.И. Роговская отмечала, что питательная ценность источников углерода различна и зависит как от их физико-химических свойств, так и от физиологических особенностей микроорганизмов. В процессе жизнедеятельности микробов часть атомов углерода окисляется сперва до СО или СООН, а затем до углекислого газа. Часть атомов углерода восстанавливается до радикалов СН₃ – СН₂ = СН и входят в состав клетки [28].

Биохимическое разрушение органики происходит в результате ряда последовательных реакций, при которых первоначальная структура вещества постепенно упрощается.

8.2.2. Биохимическая деструкция белков

Белки состоят из молекул аминокислот, в состав которых входят карбоксильные (СООН) и аминогруппы (NH₂^–), соединенные атомом углерода, а также углеродный радикал R

.

Эти группы формируют длинноцепочные молекулы с большой молекулярной массой.

Белки непосредственно не усваиваются микробами, но под действием экзоферментов гидролизуются с образованием соединений с меньшей молекулярной массой.

Аминокислоты различаются строением радикалов, которые могут быть углеводородными соединениями (СН₃ и других), но иногда включают группы ОН, NH₃, СООН, ароматическое ядро. Разнообразие белковых молекул обусловлено вариантами последовательности соединения аминокислот.

Под действием экзоферментов цепочки аминокислот расщепляются и этим переводятся в состояние, удобное для поглощения клетками. В результате внутриклеточных процессов с участием эндоферментов аминокислоты окисляются с выделением свободного аммиака (процесс аммонификации):

RCHNH₂COOH + 0,5O₂  RCOCOOH + NH₃.

Аммонификация может проходить и по другим схемам путем восстановления:

RCHNH₂COOH + 2H = RCH₂COOH + NH₃,

и прямым путем (деструкцией):

RCHNH₂COOH → RCHCHCOOH + NH₃.

Помимо аммиака продуктом распада являются кетокислоты, взаимодействие которых с аминокислотами приводит к образованию менее устойчивых кислот (процесс переаминирования):

R₁CHNH₂COOH + R₂COCOOH→ R₁COCOOH + R₂CHCNН₂COOH.

В состав некоторых белков входит сера, которая при гидролизе восстанавливается до сероводорода.

Под действием серобактерий сероводород окисляется до серы, накапливающейся в клетках, на на втором этапе под влиянием эндоферментов образуются сульфаты:

2H₂S + O₂ = 2S + 2H₂O,

2S + O₂ + 2H₂O = 2H₂SO₄.